Cxip4 contiene un motivo zcchc, es esencial y participa en el splicing en arabidopsis thaliana

Abstract

La NF-kappa B Activating Protein (NKAP) humana participa en varias facetas del metabolismo del ARN, como la ligación de exones durante el splicing y la lectura de la marca epitranscriptómica m6A en los microARN (miARN) y los ARN mensajeros (ARNm); su presunta ortóloga en Arabidopsis es MORPHOLOGY OF ARGONAUTE1-52 SUPPRESSED (MAS2). El gen MAS2 fue identificado en el laboratorio de María Rosa Ponce, en una búsqueda de supresores extragénicos del fenotipo morfológico de argonaute1-52 (ago1-52), un alelo hipomorfo y viable de AGO1. La proteína AGO1 es una endorribonucleasa que juega un papel central en el silenciamiento postranscripcional mediado por miARN. El alelo ago1-52 es portador de una mutación que daña uno de los 5'SS (sitio 5 o donante del splicing) y causa la retención parcial del correspondiente intrón. Los alelos mas2 identificados en el laboratorio de M.R. Ponce suprimen parcialmente el splicing aberrante del transcrito primario de ago1-52. En el laboratorio de M.R. Ponce se realizó también un ensayo del doble híbrido de la levadura para identificar interactores de la proteína MAS2. La presunta interactora más representada en dicha búsqueda fue CAX-INTERACTING PROTEIN 4 (CXIP4), que contiene un dedo de zinc de 18 aminoácidos denominado motivo ZCCHC o zinc knuckle, cuya estructura central es CX2CX4HX4C (C es cisteína, H es histidina, y X, cualquier aminoácido), flanqueada por dos aminoácidos no conservados en cada extremo. Se conocen muchas proteínas con motivos ZCCHC, pero son muy pocas las que se han caracterizado. En la parte inicial de esta Tesis se pretendió obtener una visión panorámica del conocimiento sobre las proteínas eucarióticas con motivos ZCCHC, que se ha plasmado en una revisión sistemática de estas proteínas presentes en Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana y Homo sapiens, en representación de los reinos de los hongos, las plantas y los metazoos, respectivamente. Hemos realizado búsquedas de proteínas que contienen la secuencia CX2CX4HX4C en bases de datos específicas de los tres organismos mencionados, utilizando los programas PatMatch para las de la levadura y Arabidopsis, y ScanProsite para las humanas. Hemos analizado la información estructural y funcional de todas estas proteínas disponible en UniProtKB, concluyendo que existen siete en la levadura, 34 en la especie humana y 69 en Arabidopsis. Aunque la mayoría de las proteínas que hemos considerado contenían un solo motivo ZCCHC, otras tenían más, hasta ocho. Los motivos ZCCHC estaban presentes en cualquier región de la proteína y aparecían solos o combinados con otros dominios o motivos, muchos de los cuales eran de unión a ARN. Además, encontramos que muchas proteínas que contienen motivos ZCCHC albergan regiones de baja complejidad, principalmente ricas en prolina (P), leucina (L), glicina (G), arginina (R) o serina (S). Muchas de las proteínas con motivos ZCCHC previamente estudiadas participan en diferentes facetas del metabolismo del ARNm, como la elongación de la transcripción, la poliadenilación, la traducción, el splicing, la exportación del ARNm maduro y su degradación, así como en la biogénesis de los ARN ribosómicos (ARNr) y los miARN, y en el silenciamiento génico postranscripcional mediado por estos últimos. Las proteínas con motivos ZCCHC son principalmente nucleares, aunque algunas tienen localización dual en el citoplasma y el núcleo, y muy pocas son exclusivamente citoplásmicas. Solo una de ellas se localiza en el cloroplasto de Arabidopsis, en donde participa en la regulación del splicing de los genes de este orgánulo que codifican ARNr. Las proteínas presuntamente ortólogas que hemos estudiado conservan su localización subcelular y el número de sus motivos ZCCHC; en algunos casos, estos motivos determinan la localización subcelular de dichas proteínas o su translocación o su unión a otras proteínas o ácidos nucleicos. Construimos un árbol filogenético con los 198 motivos ZCCHC que identificamos en siete proteínas de la levadura, 69 de Arabidopsis y 34 humanas. Encontramos que los motivos ZCCHC de la mayoría de los presuntos ortólogos se agrupan en clados, lo que indica la existencia de una mayor conservación de los aminoácidos distintos a las tres C y la H características de este motivo. La conservación de estos aminoácidos sugiere su importancia para la actividad de la proteína ancestral de la que derivan dichos ortólogos y para ellos mismos. Hemos estudiado en esta Tesis el gen CXIP4 de Arabidopsis, que está anotado como un ortólogo lejano del SREK1 Interacting Protein 1 (SREK1IP1) humano, al que se supone relacionado con el splicing. SREK1IP1 y CXIP4 solo presentan un motivo conocido: un ZCCHC, que está muy conservado y se agrupa en el árbol filogenético que hemos obtenido, lo que sugiere su trascendencia funcional. No se observan otras similitudes entre estas dos proteínas en el resto de su secuencia, aunque ambas presentan regiones de baja complejidad en su mitad carboxiterminal. Aunque existen presuntos ortólogos de CXIP4 y SREK1IP1 en muchas plantas y animales, no se ha descrito ningún alelo mutante. Hemos caracterizado los mutantes insercionales cxip4-1 y cxip4-2, que son portadores de un alelo nulo y otro hipomorfo de CXIP4, respectivamente. La letalidad postembrionaria temprana de cxip4-1 indica que CXIP4 es esencial en Arabidopsis. La viabilidad de cxip4-2 nos ha permitido establecer la implicación de CXIP4 en varias rutas de desarrollo, ya que este mutante presenta un fenotipo muy pleiotrópico en todas las fases de su ciclo de vida. La pleiotropía del fenotipo morfológico de cxip4-2 se corresponde con su perfil transcriptómico, ya que una parte importante de sus genes desregulados codifican factores de transcripción cuya desregulación podría explicar diferentes rasgos de su fenotipo. Hemos analizado el splicing global de las plantas mutantes cxip4-2, constatando un incremento del splicing alternativo, principalmente de los eventos de retención intrónica, aunque menor que los descritos en mutantes portadores de alelos de genes que codifican componentes del espliceosoma. Hemos confirmado algunos de los eventos de retención intrónica diferencial entre Col-0 y cxip4-2, utilizando para ello plantas del mutante presuntamente nulo cxip4-1, en el que las alteraciones del splicing son más evidentes, como esperábamos. Estos resultados sugieren que CXIP4 participa directa o indirectamente en el splicing de los pre-ARNm. El análisis del enriquecimiento en categorías funcionales de los genes que sufren splicing alternativo y se comportan diferencialmente en cxip4-2 respecto a la estirpe silvestre sugiere que CXIP4 controla el splicing alternativo de grupos específicos de genes, entre ellos los implicados en la degradación de ARNm mediante desadenilación y la represión epigenética mediante metilación guiada por ARN no codificantes. La acumulación nuclear de ARN poliadenilados que hemos observado en las plantas cxip4-2 es compatible con la implicación de CXIP4 en el splicing y refuerza la hipótesis de la conservación de las funciones de la SREK1IP1 humana y la CXIP4 de Arabidopsis.